引物合成常见问题


            引物常见问题解答

            A:
            我们的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。
            A:
            没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数管保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液后进行实验。
            A:
            用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。
            A:

            1个OD值的Oligo的重量约为33 μg,而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此, 合成oligo的nmol数一般按以下公式粗略地计算: nmole数=(OD值x33μg)/(碱基数x330)x1000=OD值/碱基数x100

            如果需要计算合成DNA的精确浓度,请按以下公式进行计算: nmole数=(OD值x1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]

            A:
            通常在合成长链引物时,试剂的加入量要比短链引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,从而导致价格也要增加。

            DNA合成常见问题

            A:
            实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。
            A:
            没有,5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,则需要使用修饰合成增加磷酸化。
            A:
            由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同,例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度。
            A:
            对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。
            A:

            PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。

            • 引物和模板是否配对,同源性有多大;
            • 引物本身是否有立体结构;
            • PCR反应用试剂是否能正常工作;
            • PCR仪是否工作正常;
            • PCR反应条件是否合适;
            • 如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。
            A:
            不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。
            A:
            • 因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。
            • 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。
            • 如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。

            qPCR引物探针常见问题

            A:

             

            引物设计原则

            扩增片段大小

            80-300bp

            Primer长度

            17-25 碱基

            GC含量

            40-60%(最好45-55%

            Tm

            57-63℃,两条引物的Tm值尽量接近,差距不得超过5。

            序列

            整体上碱基不能过偏,局部避免GC richAT rich(特别是3’端)

            3’末端序列

            避免GC含量过高,3’末端碱基最好为GC,尽量避免3’末端碱基为T,3’端最后一个碱基不能互补自连。

            互补性

            引物内部或Probe与两条引物之间避免3 个碱基以上的互补序列,引物3’末端避免2 碱基以上的互补序列

            特异性

            保证单一结合位点,使用BLAST检索,确认引物特异性

            RT-PCR用引物

            尽量在Exon junction上设计引物,限制基因组DNA扩增。

             

            探针设计原则

            Probe长度

            20-32 base

            Tm

            探针的Tm比引物高8-10℃

            序列

            在目的序列GC含量相对较高的区域设计,整体上碱基不能过偏,局部避免GC richAT rich(特别是3’端)

             

            探针序列尽量接近正向或反向引物,但不能重合一般相隔10个碱基以内,相隔一个碱基最好。

            5’末端序列

            探针5’末端的第一个碱基不能是G

            互补性

            Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 个碱基以上的互补序列

            特异性

            保证单一结合位点,BLAST检索确认Probe特异性

            A:
            需要避光在-20℃环境下保存,使用棕色管分装,优先推荐使用TE Buffer来稀释并保存探针(也可以使用弱碱性的nuclease-free H2O),建议事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数管保存于-20℃冰箱,避免反复多次冻融降低使用寿命。使用前,将储存液稀释成工作液后进行实验即可。
            A:
            使用较高浓度的模板按3~4个梯度稀释,并使用其进行Real Time RT-PCR反应或Real Time PCR反应。如果无抑制物质存在,得到的Ct值会依存模板浓度的变化而变化;如果有抑制物质存在,就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。 抑制物的影响或可通过稀释样本消除
            A:
            目的不同 绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。绝对定量需要制作标准曲线。 相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。 原理不同 相对定量:利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系,来计算不同样本之间的相对百分比。 绝对定量PCR:是利用荧光信号的变化,实时检测PCR扩增反应中每次循环扩增产物量的变化,通过循环阈值和标准曲线的分析对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。
            A:
            模板量过高及基线范围设置不当,建议重新设置基线范围(基线终点设计为Ct值-4)。
            A:

            仪器需要校准,可能在扩增过程中仪器出现波动或者检测孔本身出现异常,建议定期校准仪器。

            扩增信号太弱,经系统矫正后,就会产生不平滑的线,可以通过提高模板浓度和纯度重复实验。

            A:
            原因可能为ROX参比染料设置不当,应仔细对比仪器所需的ROX参比染料类型,设定参比为None观察是否扩增曲线恢复正常。
            A:
            反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。 引物设计的不够好,容易形成二级结构或是不易退火,重新设计新的引物进行实验。 试剂未充分混匀或移液误差,建议重复实验。 qPCR试剂的影响:试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化,导致Taq酶活力未达最强。
            A:
            原因可能为模板浓度太低、体系有抑制和扩增效率低,建议适当提高模板浓度,优化反应条件(见扩增效率低),或尝试更换试剂。
            A:
            原因可能为模板浓度过高,体系内有污染,引物形成二聚体。建议适当增加稀释比例,更换所有试剂杜绝污染,重新设计不容易形成二聚体或非特性扩增的引物序列。
            A:
            扩增曲线存在问题时,首先应确认基线校正或ROX校正前的原始曲线,扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。 使用SYBR Green染料法进行检测时,背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高,染料嵌入到初始模板DNA中发出荧光造成的。使用探针法进行检测时,背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针质量差使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理、探针的荧光标记效率低等原因造成的。
            A:
            分液不准确,检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管; 反应管气密性差,反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加,导致曲线呈斜直线状。
            A:
            反应体系污染,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效,建议用新的试剂做对比实验。仪器长时间未校准。
            A:
            可能原因是引物二聚体形成或引物特异性较差,建议重新设计引物。 杂峰在主峰之前,Tm约为70-75℃——一般为引物二聚体,可以尝试重新设计引物或提高模板浓度、退火温度或者降低引物浓度来进行改善;另外,当目的基因表达量极低时,染料法容易形成引物二聚体产物影响实验结果,此时,建议使用探针法定量。 杂峰在主峰之后,可能是引物特异性不好引起的非特异性扩增,也可能是空气中有气溶胶污染所导致。
            A:
            原因可能是有Tm非常接近的双链分子,建议使用琼脂糖电泳分析一下产物,观察条带情况。