基因敲除:移码突变

            CRISPR/Cas是一种原核生物的自适应免疫系统,抵御来自噬菌体或外源质粒的入侵。这个原核生物系统的已广泛被分子生物学所采用,目前已成为基因组工程最强大和最通用的平台之一。 CRISPR/Cas9是一种简单而快速的工具,不仅可对各种物种(动物、植物、微生物等)中的内源基因进行有效修饰(敲除、敲入、定点突变),对其进行优化还可实现强大的转录抑制或靶基因的激活。CRISPR/Cas9的简便性使其在许多领域广泛应用,包括基础研究,生物技术和生物医学[1,2,3]。
            CRISPR/Cas9编辑系统是在sgRNA(约20nt,与靶基因序列互补)的引导下,Cas9特异性切割目标基因,造成DNA双链的断裂(double-strand DNA breaks,DSBs),从而引起生物体内的DNA损伤修复。这种修复作用主要包括两种途径,一种是利用非同源重组(NHEJ)的修复,即易错修复,可能造成基因组的随机插入或缺失突变,这种方式常导致靶基因失去功能,基因敲除就是利用该修复机制[1,2]。另一种是利用同源重组修复(HDR),即精准修复,借助外源引入一段与预期编辑位点上下游紧邻且高度同源的DNA修复模板(donor,可以是短单链DNA序列(ssDNA)或质粒)介导序列的替换或插入,基因敲入和定点突变就是利用该修复机制[3]。



            服务标准

               客户需提供 金唯智交付  交付周期 
             标准服务 基因序列和NCBI ID
            宿主细胞
            细胞株培养条件
            基因敲除单克细胞一株(纯合/杂合)
            细胞cofA文件
            测序结果
             8-10周
            基因序列和NCBI ID
            宿主细胞
            细胞株培养条件 
             基因敲除阳性pool
            细胞cofA文件
            测序结果
              4-6周
             附加服务  -  额外单克隆交付  -
             Western blot/FACS抗体  敲除细胞株蛋白水平验证结果  1-2周
             -  敲除细胞株mRNA水平验证  1-2周

             

             
            *注:一般由客户提供宿主细胞系,如果需要由金唯智提供宿主细胞系,需要额外收费。
            *如果宿主细胞使用的是常规培养基,如:RPM1640、DMEM、MEM等无需客户提供,如果是特殊培养基及添加物,需要客户提供。

             

            敲除细胞系构建流程:

            敲除细胞系构建流程

             
            案例分析1:CRISPR-Cas9 Mediated NOX4 Knockout Inhibits Cell Proliferation and Invasion in HeLa Cells.
             
            活性氧(ROS)参与了多种作为细胞内信号分子的生物过程。NADPH氧化酶负责产生活性氧,NADPH氧化酶4(NOX4)是NOX/DUOX家族的成员,其中包括7种亚型(NOX1-5和DUOX 1-2),而NOX4是最丰富的亚型之一并广泛表达NOX异构体。 NOX4负责生产H2O2,NOX4在肾脏中的表达特别高。因此很多研究集中于NOX4在肾脏生理和病理生理中的作用[4]。作者利用CRISPR技术对Hela细胞中的NOX4基因进行敲除[4]。

            20210226-1

            图1. [4]
              
            针对NOX4的3号外显子设计2条sgRNA序列,如下,gRNA #1:5’-CACCGGCACATGGGTAAAAGGATG-3’;gRNA #2 :5’-AAACTA TCCTTTTACCCATGTGCC-3’。sgRNA构建至 pX459 CRISPR/Cas9-Puro vector (Addgene, Cambridge, MA)。Hela细胞转染后的的PCR产物进行T7E1分析,使用Puro筛选阳性细胞,并分单克隆。测序结果和WB结果表明#1-2、#1-5、#1-6这三个克隆的NOX4基因均已成功敲除[4]。

            参考文献:
            [1] Nelly M. Cruz and Benjamin S. Freedman. CRISPR Gene Editing in the Kidney. Author manuscript, Am J Kidney Dis . 2018;71(6): 874–883.
            [2] Hryhorowicz M, Lipinski D, Zeyland J, et al. CRISPR/Cas9 immune system as a tool for genome engineering. Arch Immunol.2017;65(3):233–240.
            [3] Savi′c, N.; Schwank, G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Transl. Res.2016; 168,15–21.
            [4] Jafari N, Kim H, Park R, Li L, Jang M, Morris AJ et al. CRISPR-Cas9 mediated NOX4 knockout inhibits cell proliferation and invasion in HeLa cells. PLoS One.2017;12:e0170327.

             

             

            金唯智提供的CRISPR/Cas9技术服务的授权来自Broad研究所。